طیف بینی فرابنفش- مرئی  (Ultraviolet and Visible Spectroscopy)یکی از پرکاربردترین روش های آنالیز مواد  شیمیایی است. دستگاه اسپکتروسکوپی UV-Vis در بیشتر آزمایشگاه ها برای شناسایی و اندازه گیری ترکیبات آلی و غیرآلی برای محدوده وسیعی از محصولات و فرایندها شامل مواد غذایی، دارو و کود، محصولات پتروشیمی، رنگ ها، اسانس ها، پروتئین ها و نوکلئیک اسیدها به کار می رود. حضور اسپکتروفوتومترها برای بیشتر رشته ها اعم از بیولوژی مولکولی، داروسازی، صنایع غذایی و کشاورزی و … هم برای کنترل های روزانه و هم تحقیق و توسعه ضروری هستند.

طیف‌سنجی UV-Vis بررسی برهمکنش نور فرابنفش و مرئی با ماده در سطوح الکترونی است. این بررسی در ناحیه ۱۸۰ نانومتر تا ۸0۰ نانومتر طیف الکترومغناطیس انجام شده و برای آنالیز کمی و کیفی و همچنین تعیین رفتار نوری ترکیبات شیمیایی، شناسایی گونه‌های مختلف و اندازه‌گیری مقدار آنالیت‌های خاص مورد استفاده قرار می‌گیرد. علاوه براین، این آنالیز، یک آزمون ابتدایی برای اندازه گیری طول موج جذب، اندازه گیری بند گپ، بررسی پیشرفت واکنش و اندازه گیری اندازه برخی نانو ذرات است.

در هنگام برخورد پرتو الکترومغناطیسی با نمونه، پدیده‌هایی مانند عبور(Transmission)، انعکاس (Reflection)، انکسار (Refraction) و جذب (Absorption) رخ می دهد. در این میان، پدیده جذب فرآیندی است که در آن یک نمونه به صورت انتخابی، فرکانس‌‎های خاصی از پرتو الکترومغناطیسی را جذب می کند. با جذب پرتو، پرتو تابیده شده به نمونه تضعیف می شود. جذب تابش الکترمغناطیسی در این ناحیه سبب برانگیختگی الکترون ها بین ترازهای الکترونی می‌گردند. هنگامی که مولکولی انرژی جذب کند، یک الکترون از یک اوربیتال اشغال شده به یک اوربیتال اشغال نشده با انرژی پتانسیل بالاتر ارتقا می‌یابد. الکترون های پیوندی، یا الکترون های لایه ظرفیت، بیشتر تحریک شده و معمولا محتمل‌ترین انتقال، از بالاترین اوربیتال مولکولی اشغال شده (HOMO) به پایین ترین اوربیتال مولکولی اشغال نشده (LUMO) است. وقتی تابش الکترومغناطیسی از درون نمونه ای عبور می کند، بعضی طول موج ها توسط مولکول های نمونه جذب می شوند و مولکول های نمونه با انرژی حاصل از تابش برانگیخته می شوند. بنابراین هرمولکول یا ترکیب طیف جذبی خاص خود را دارد که این طیف یکی از مشخصه های فیزیکی هر ترکیب است که هم برای شناسایی ترکیب (آنالیز کیفی) و هم برای تخمین و اندازه گیری (آنالیز کمی) بسیار کاربرد دارد.

از آنجایی که در روش آنالیز UV-Vis شدت جذب در هر طول موج وابسته به غلظت آن ماده یا عامل است، از روش UV-Vis می‌توان برای مقایسه مقدار یک ماده یا اندازه گیری غلظت یک ماده نیز استفاده کرد. رابطه بین جذب و غلظت با استفاده از رابطه  بیر-لمبرت بیان می شود. بر اساس این قانون، جذب مستقیما با طول مسیر  (b)از درون محلول و غلظت (c) ماده جاذب متناسب است و به این ترتیب خواهیم داشت:

A=log P₀/P=abc

در این رابطه a یک ثابت تناسب است و ضریب جذب نامیده می شود. اندازه a به مقادیر به کار رفته برای b و c بستگی دارد b .اغلب بر حسب سانتی متر و c بر حسب گرم در لیتر داده می شود. چنانچه غلظت در معادله بالا بر جسب مول بر لیتر و طول مسیر  بر حسب سانتی متر بیان شود، ضریب جذب را ضریب جذل مولی می نامند و آن را با نماد ε نشان می دهند. لذا در این حالت خواهیم داشت:

A=εbc

لازم به ذکر است که قانون بیر-لمبرت در محلول حاوی بیش از یک نوع جسم جاذب نیز اعمال می شود. در صورتی که برهمکنشی بین گونه های مختلف روی ندهد، جذب کل برای سیستم چند جزئی به صورت زیر خواهد بود:

A_total = A₁+A₂+A₃ + … + A_n=ε₁b₁c₁ + ε_nb_nc_n

باید دقت کنید که این قانون تنها در توصیف رفتار جذب محلول های رقیق موفقیت دارد و معمولا در غلظت های بزرگتر از M 01/0 فاصله های میانگین ذرات جاذب به حدی کاهش می یابد که هر ذره بر توزیع بار همسایه های خود اثر می گذارد. این برهمکنش توانایی ذرات برای جذب یک طول موج تابش را تغییر می دهد.

انواع اسپکترومترهای UV-Vis

دو نوع اسپکتروفتومتر UV-Vis وجود دارد:

• اسپکتروفتومتر تک پرتوی UV-Vis
• اسپکتروفتومتر دو پرتوی UV-Vis

اسپکتروفتومتر تک پرتوی UV-Visible

اسپکتروفتومتر تک پرتوی UV-Visible دارای یک پرتو است، همانطور که از نام آن پیداست. نور ورودی از منبع از طریق یک مونوکروماتور عبور می کند و سپس نور تک رنگ ورودی از طریق یک شکاف وارد محلول نمونه می‌شود. در اینجا بخشی از نور ورودی توسط نمونه جذب می شود و بخش دیگری عبور می‌کند. نور عبوری توسط دتکتور تشخیص داده می شود و سپس تقویت، ضبط شده و در یک دستگاه مناسب نمایش داده می شود. در نهایت طیف رسم شده و λmax مشخص می شود.

اسپکتروفتومتر دو پرتوی UV-Visible  

ابزار دقیق اسپکتروفتومترهای تک و دو پرتوی تقریباً یکسان است و تفاوت اساسی آنها در این است که در اسپکتروفتومتر تک پرتویUV-Vis ، نور ورودی به طور همزمان از سلول های نمونه و مرجع عبور می کند. در نهایت پرتوی نور عبوری توسط دتکتورها تشخیص داده می شود. اسپکتروفتومتر دو پرتو UV-Vis نیاز به دو دتکتور برای اندازه گیری یا محاسبه جذب در نمونه آزمایشی دارد.

اصول دستگاهی طیف‌سنجی UV-visible

ابزارهای اصلی طیف‌سنجی UV-vis شامل موارد زیر هستند:

• منبع نور
• انتخاب کننده طول موج
• ظرف نمونه یا کووت
• دتکتور
• منبع نور

منابع نوری که در ناحیه فرابنفش و مرئی قرار دارند، به عنوان منابع تابش اسپکترومتر UV-Visible استفاده می‌شوند.

• لامپ‌های هیدروژن و دوتریوم که در بازه ۱۶۰-۳۸۰ نانومتر قرار دارند.
• لامپ‌های قوس زئون که در بازه ۲۵۰-۶۰۰ نانومتر قرار دارند.
• لامپ‌های تنگستن هالوژن که در بازه ۲۴۰-۲۵۰۰ نانومتر قرار دارند.

• انتخاب کننده طول موج

اسپکتروسکوپی UV-Vis نیاز به یک طول موج تک دارد تا عملکرد صحیح و دقیق داشته باشد. در حالی که خروجی یک طول موج تک امکان پذیر نیست و به همین دلیل از یک باند تابش استفاده می‌شود و هرچه پهنای باند باریک باشد بهتر خواهد بود.

انواع انتخاب کننده‌های طول موج شامل موارد زیر هستند:

• فیلترها
• مونوکروماتورها

فیلترها

فیلترها برای عبور یک باند خاص از طول موج استفاده می‌شوند. ساده‌ترین نوع فیلتر، فیلتر جذب است و بیشتر از همه از فیلترهای شیشه‌ای رنگی استفاده می‌شوند. آن‌ها بخشی از گسترده طیف را جذب می‌کنند (رنگ‌های مکمل) و بخش‌های دیگر را انتقال می‌دهند (رنگ خودشان).

مزایای فیلترها

• فیلترها ارزان هستند.
• از لحاظ فنی ساده هستند.

معایب فیلترها

• فیلترها فقط در ناحیه مرئی قابل استفاده هستند.
• آن‌ها انتخاب کننده‌های طول موج خوبی نیستند.
• برای اهداف تحقیقاتی مناسب نیستند زیرا پهنای باند گسترده را عبور می‌دهند و احتمال انحراف از قانون بیر-لمبرت بیشتر است.

مونوکروماتورها

مونوکروماتور یک دستگاه نوری است که برای انتخاب یک باند باریک از طول موج نور استفاده می‌شود و دارای ساختار منشور کوارتز یا شبکه‌ای است.

کاربردهای مونوکروماتورها

مونوکروماتورها برای اسکن طیفی، یعنی تغییر طول موج تابش در یک محدوده استفاده می‌شوند و می‌توانند در ناحیه UV-Visible مورد استفاده قرار گیرند.

اجزای یک مونوکروماتور

همه مونوکروماتورها در ساخت مکانیکی مشابه هستند و اجزای اصلی آنها عبارتند از:

• شکاف
• آینه
• لنز
• شبکه / منشور
• ظروف نمونه / سل‌ها یا کووت

ظروف نمونه یا کووت که تصویر آنها در شکل زیر نمایش داده شده است معمولا از جنس ترکیبات زیر هستند:

• کوارتز
• بوروسیلیکات
• پلاستیک

• تنها کوارتز در هر دو ناحیه UV و مرئی شفاف است (۲۰۰-۷۰۰ نانومتر).

• شیشه و پلاستیک فقط برای ناحیه مرئی مناسب هستند.
• شیشه برای ناحیه UV مناسب نیست زیرا تابش UV را جذب می‌کند و در این ناحیه شفاف نیست.
• سل‌های پلاستیکی برای حلال‌های آلی استفاده نمی‌شوند.

اندازه کووت

معمولاً اندازه کووت ۱ سانتیمتر است، اگرچه ممکن است از 1/0 تا 10 سانتیمتر متغیر باشد.

• دتکتورها

دتکتورها یا آشکارسازها دستگاه‌هایی هستند که وجود برخی پدیده‌های فیزیکی را نشان می‌دهند. برخی از انواع دتکتورهای ساده عبارتند از:

• مبدل‌ها (Transducers)   
• فتودتکتورها (Photodetectors)
• فیلم‌های عکاسی
• سطح جیوه در ترمومترها (تشخیص دما)
• چشم انسان

مبدل‌ها

مبدل یک نوع خاص از دتکتور است که سیگنال‌هایی مانند شدت نور، pH، جرم و دما و غیره را به سیگنال‌های الکتریکی تبدیل می‌کند. این سیگنال الکتریکی تقویت و تغییر شکل یافته و به صورت اعداد (شکل دیجیتال) نمایش داده می‌شوند.

ویژگی‌های مبدل‌ها

• مبدل‌ها پاسخ سریعی به سطوح پایینی از انرژی تابشی دارند.
• برای یک دامنه گسترده از طول موج‌ها مناسب هستند.
• سیگنال‌های الکتریکی تولید شده توسط مبدل‌ها باید نویز کمی داشته باشند.
• سیگنال تولید شده توسط مبدل‌ها به طور مستقیم به تابش توان متناسب است.

فتودتکتورها

فتودتکتورها به عنوان موارد زیر استفاده می‌شوند:

• فوتولوله‌ها
• لوله‌های فتومولتی پلایر
• دیودهای سیلیکون
• سل‌های فتوولتائیک

فوتولوله‌ها

فوتولوله‌ها نوعی فتودتکتور هستند. در ساختار آنها سطوح خمیده کاتدی و آندی درون یک بطری شیشه‌ای قرار دارند. کاتد با ماده نشرکننده نور (photoemissive) مانند سریم، اکسید پتاسیم، اکسید نقره و غیره پوشش داده شده است و آند یک صفحه یا حلقه فلزی با ولتاژ بالا است. داخل بطری شیشه‌ای نیز با گاز بی‌اثر در فشار کم پر شده است.

لوله‌های فتومولتی پلایر

لوله‌های فتومولتی پلایر به صورت داینودهای تکراری (dynode) در زاویه‌های خاص ساخته می‌شوند. الکترون‌های تولید شده بر روی داینودهای مختلف برخورد می‌کنند. هر داینود دارای ولتاژ بالاتری نسبت به داینودهای قبلی است. این تفاوت ولتاژ الکترون‌ها را شتاب می‌دهد و با برخورد الکترون‌های سریع با داینودهای بعدی الکترونهای بیشتری جمع آوری می‌شود.تکرار این فرآیند باعث جمع‌آوری تا ۱۰^۶ الکترون به ازای هر فوتون که بر روی کاتد اول برخورد می‌کند می‌شود. لوله‌های فتوضعیف‌کننده نسبت به لوله‌های فتو حساس و هزینه‌بر هستند.

مزایا و محدودیت‌های طیف سنجی UV-Vis

مزایای طیف سنجی UV-Vis

طیف سنجیUV-Vis ، مانند هر فناوری دیگری، نقاط ضعف خود را دارد. محبوبیت این تکنیک به دلیل مزایای قابل توجه آن است که در زیر آورده شده است.

• چند منظوره بودن :طیف سنجی UV-Vis می‌تواند برای مطالعه نمونه‌های متنوعی در حالت‌های مختلف مانند محلول‌ها، ترکیبات دیسپرس شده و امولسیون‌ها استفاده شود.
• غیرمخرب بودن: این روش غیرمخرب است و به نمونه اجازه می‌دهد مجدداً استفاده شود یا برای پردازش و آنالیز بیشتر مورد استفاده قرار گیرد.
• سرعت بالا: اندازه‌گیری‌های سریع امکان یکپارچه‌سازی ساده در روش‌های آزمایشگاهی را فراهم می‌کند.
• حساسیت بالا :طیف سنجی UV-Vis یک تکنیک بسیار حساس است که حتی ترکیبات بسیار کم از یک ماده را در نمونه تشخیص می‌دهد.
• سادگی استفاده  :ابزارهای این تکنیک در عمل بسیار ساده بوده و نیاز به آموزش حداقلی قبل از استفاده دارند.
• قابلیت آنالیز کمی :طیف سنجی UV-Vis می‌تواند برای تعیین غلظت یک ماده در نمونه استفاده شود.
• هزینه کم: تجهیزات طیف سنجی UV-Vis هزینه نسبتاً کمی دارند و استفاده و نگهداری آن‌ها آسان است.
• دسترسی گسترده :طیف سنجی UV-Vis در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و صنعتی به طور گسترده‌ای در دسترس است، که آن را برای مجموعه گسترده‌ای از کاربردها قابل دسترس می‌کند.
• رزولوشن بالا :طیف سنجی UV-Vis می‌تواند برای مطالعه نمونه‌ها با رزولوشن بالا استفاده شود که این امر امکان تجزیه و تحلیل دقیق نمونه را فراهم می‌کند.
• گستردگی کاربردها :طیف سنجی UV-Vis دارای مجموعه گسترده‌ای از کاربردها در شیمی تجزیه، بیوشیمی، علوم مواد و در صنایعی مانند داروسازی، غذا، آب و تجزیه و تحلیل محیطی و غیره است.

محدودیت‌های طیف سنجی UV-Vis

اگرچه مزایای این روش بسیار زیاد است، اما برخی نقاط ضعف نیز در این طیف سنجی وجود دارند:

• خطای دستگاهی :در ابزار عملی این تکنیک، انتخاب کننده طول موج دقیق نیست و مقدار کمی از طیف گسترده‌ طول موج‌ها ممکن است از منبع نور منتشر شود که منجر به خطاهای قابل توجه در اندازه‌گیری شوند.
• پراکندگی نور :ذرات معلق در نمونه‌های مایع اغلب باعث پراکندگی نور می‌شوند که می‌تواند منجر به خطاهای قابل توجه در اندازه‌گیری شود. حضور حباب‌ها در کووت یا نمونه، نور را پراکنده می‌کند و منجر به نتایج غیر قابل تکرار می‌شود.
• تداخل از چندین گونه جذب کننده :ممکن است نمونه شامل انواع مختلفی از پیگمنت سبز کلروفیل باشند که در اینصورت طیف آن‌ها با هم تداخل خواهد داشت. برای تجزیه و تحلیل کمی دقیق، هر گونه شیمیایی باید از نمونه استخراج شده و به صورت جداگانه تجزیه و تحلیل شود.
• تداخل :طیف سنجی UV-Vis ممکن است تحت تأثیر تداخلاتی مانند پراکندگی نور و فلورسانس قرار گیرد که می‌تواند منجر به دست‌یابی نتایج غیردقیق شود.
• آماده‌سازی نمونه :برخی از نمونه‌ها نیاز به آماده‌سازی یا کاربرد خاص قبل از تجزیه و تحلیل با استفاده از طیف سنجی UV-Vis دارند که ممکن است زمان‌بر باشد.
• محدود به گروه‌های عملکردی خاص :طیف سنجی UV-Vis حساس به گروه‌های عملکردی خاصی مانند پیوندهای دوگانه و حلقه‌های آروماتیک است که این امر توانایی آن را در تشخیص سایر گروه‌های عملکردی محدود می‌کند.
• نمونه‌های پیچیده :طیف سنجی UV-Vis ممکن است هنگام آنالیز نمونه‌های پیچیده مانند نمونه‌های بیولوژیکی شامل چندین مولکول که در یک طول موج نور جذب می‌کنند، پیچیدگی داشته باشد.
• محدود به نمونه‌های شفاف :طیف سنجی UV-Vis نیازمند این است که نمونه در طول موج‌های مورد نظر شفاف باشد و برای نمونه‌هایی که غیرشفاف یا بسیار رنگی هستند مناسب نیست.
• نیاز به مهارت بالا جهت تفسیر طیف :طیف سنجی UV-Vis نیازمند مهارت بالا برای عملکرد و تفسیر نتایج است که ممکن است برای برخی از افراد میسر نباشد.

کاربردهای اسپکتروسکوپی UV-Vis

هدف اصلی طیف‌سنجی UV تعیین ویژگی‌های جذب یا انتقال یک نمونه در ناحیه فرابنفش (UV) طیف الکترومغناطیسی است. با اندازه گیری میزان جذب نور توسط یک نمونه در طول موج های مختلف، محققان می توانند در مورد ترکیب شیمیایی، ساختار الکترونیکی و سایر خواص آن اطلاعات کسب کنند. طیف سنجی UV در طیف گسترده ای از کاربردها استفاده می شود، از جمله:

• شیمی تجزیه‌ : طیف‌سنجی UV-Vis برای تعیین غلظت یک ماده در نمونه، شناسایی ترکیبات ناشناخته و نظارت بر واکنش‌های شیمیایی استفاده می‌شود.
• بیوشیمی : طیف‌سنجی UV-Vis برای مطالعه ساختار و عملکرد بیومولکول‌ها مانند پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و رنگدانه‌ها استفاده می‌شود.
• محیط زیست :طیف‌سنجی UV-Vis برای نظارت بر کیفیت آب و هوا، شناسایی آلاینده‌ها و مطالعه فوتوشیمی گازهای جوی استفاده می‌شود.
• صنعت غذا :طیف‌سنجی UV-Vis برای اندازه‌گیری غلظت مواد غذایی، نظارت بر کیفیت محصولات غذایی و شناسایی آلودگی‌ها استفاده می‌شود.
• علم مواد :طیف‌سنجی UV-Vis برای مطالعه خواص الکترونیکی و نوری مواد مانند نیمه‌رساناها، رنگدانه‌ها و رنگدانه‌ها استفاده می‌شود.
• شیمی آلی :طیف‌سنجی UV-Vis برای مطالعه ساختار الکترونیکی مولکول‌های آلی، شناسایی گروه‌های عملکردی و مطالعه مکانیزم و سنیتیک واکنش‌های شیمیایی استفاده می‌شود.
• تحقیقات بیولوژیکی :طیف‌سنجی UV-Vis برای مطالعه خواص خون، نظارت بر سطح گلوکز در خون و مطالعه فوتوشیمی سیستم‌های زیستی استفاده می‌شود.
• پزشکی قانونی :طیف‌سنجی UV-Vis برای تجزیه و تحلیل شواهد ردیابی مانند الیاف و رنگ، شناسایی منبع نمونه استفاده می‌شود.
• فرآیند صنعتی :طیف‌سنجی UV-Vis برای نظارت بر پیشرفت واکنش‌های شیمیایی در فرآیندهای صنعتی، بهینه‌سازی شرایط و کنترل کیفیت محصول نهایی استفاده می‌شود.

شرایط خاص و نکات مهم آنالیز UV-Vis

رعایت نکات زیر برای پذیرش نمونه های ارسالی ضروری است:

1- برای نمونه هایی که از حلال (دیسپرسانتی) استفاده نموده اند، در صورت نیاز به رقیق سازی تأمین حلال بر عهده متقاضی می باشد و باید ارسال شود.

2- در صورتی که متقاضی نمونه پودری برای آنالیز محلولی فرستاده باشد، هزینه آماده سازی به هزینه آنالیز اضافه می شود.

3- لطفاً هر یک از نمونه ها را در ظروف مجزا و مناسب ارسال فرمایید.

شرایط نمونه برای آنالیز UV-VIS

برای انجام آزمون و آنالیز UV-VIS نمونه‌ها می‌توانند به صورت محلول، کلویید و یا پودری باشند. در رابطه با نمونه‌های پودری، پودر باید در محیط مناسب (معمولا آب یا الکل) دیسپرس شود به صورت کلوییدی تبدیل شود. این کار توسط اپراتور دستگاه قابل انجام است ولی متقاضی باید محیط مناسب را معرفی کند. در رابطه با نمونه‌های کلوییدی، بهتر است قبل از انجام آزمون نمونه توسط حمام التراسونیک دیسپرس شود تا نتایج بهتری بدست بیاید.

نتایج آنالیز UV-Vis

نتایج آزمون UV-VIS به صورت یک فایل اکسل و یک فایل تصویری گزارش می‌شود که این فایل اکسل شامل نتایج نقطه به نقطه شدت جذب بر حسب طول موج است.

مشخصات نمونه:

مقدار ماده مورد نیاز:  حداقل حجم ۵ سی سی، نمونه پودری 10 میلی گرم

عودت نمونه : ندارد

نوع جوابدهی:  فایل اکسل

قابلیت دستگاه :توانایی قرائت جذب در یک طول موج (در صورت تمایل به انجام این خدمت حتما در فرم خود اعلام فرمایید .)

نمونه ی حساس به دما برای این دستگاه پذیرش نمی شود.

مدت زمان انجام آنالیز 3 روز کاری

تعرفه آنالیز: