کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
آنالیز کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، یک تکنیک تحلیلی پیشرفته و پرکاربرد در علم مواد، شیمی، داروسازی و محیط زیست است. این روش با استفاده از کروماتوگرافی مایع(LC)، اطلاعات دقیقی درباره ترکیب و شناسایی مولکول‌های مختلف در نمونه‌های پیچیده ارائه می‌دهد.
برخلاف روش کروماتوگرافی گازی که در آن ماده ورودی به ستون جدایش باید به صورت گازی باشد، در کروماتوگرافی مایع، خود محلول مایع می‌تواند مستقیماً وارد ستون شود. از این رو برای بررسی محلول‌هایی که فرار نیستند و یا محلول‌هایی که به دما حساس هستند باید از کروماتوگرافی مایع (LC) استفاده کرد.
در این روش، یک نمونه ابتدا توسط کروماتوگرافی مایع جداسازی می‌شود و سپس مولکول‌های جداشده توسط یک آشکارساز مانند UV، فلوئورسانس یا طیف‌سنجی جرمی شناسایی و تحلیل می‌شوند. این تکنیک امکان شناسایی و تجزیه و تحلیل مولکول‌های مختلف با دقت بالا را فراهم می‌کند.
اصول کار آنالیز HPLC
اساس جداسازی در روش های کروماتوکرافی تمایل نسبی هر جزء به فاز ساکن به هنگام عبور فاز متحرک بر روی فاز ساکن است. به این صورت که گونه ای که تمایل بیشتری به فاز ساکن دارد با سرعت کمتری در طول ستون حرکت می کند و گونه ای که تمایل بیشتری به فاز متحرک دارد با سرعت بیشتری از ستون عبور می کند.
در آنالیز HPLC نمونه ای که باید جداسازی و بررسی شود در مقادیر بسیار اندک از طریق یک ستون به جریان فاز متحرک تزریق می شود. ستون های مختلفی وجود دارد که دارای جاذب هایی با اندازه و سطوح مختلفی از ذرات هستند.
مخلوط حاوی نمونه با سرعت های متفاوتی از ستون عبور کرده و با ماده جاذب که به عنوان فاز ثابت شناخته می شود، واکنش می دهد. سرعت هر جزء در مخلوط به ماهیت شیمیایی آن، ماهیت ستون و ترکیب فاز متحرک بستگی دارد. زمانی که یک آنالیت خاص در ستون پدیدار می شود، به عنوان زمان بازداری شناخته می شود. مدت زمان بازداری تحت شرایط خاص اندازه گیری می شود و به عنوان مشخصه شناسایی یک آنالیت معین در نظر گرفته می شود.
ذرات جاذب ممکن است از نظر طبیعت آبگریز یا قطبی باشند. فازهای متداول مورد استفاده شامل ماده قابل ترکیب با آب و حلال های آلی مانند استونیتریل و متانول است. از فازهای متحرک بدون آب نیز می توان استفاده کرد.
اجزاء محلول فاز متحرک ممکن است حاوی اسیدهایی مانند اسید فرمیک، اسید فسفریک یا تری فلوئورواستیک اسید و یا نمک باشد تا جداسازی اجزای نمونه را فعال کند. ترکیب فاز متحرک در طول کروماتوگرافی می تواند به صورت ثابت یا متغیر حفظ شود.
روش ثابت برای جداسازی اجزای یک نمونه که از نظر میل برای فاز ثابت خیلی متفاوت نیستند، مؤثر است. در روش متغیر، ترکیب فاز متحرک از استحکام شستشوی کم تا زیاد متفاوت است. استحکام شستشوی فاز متحرک توسط زمان های بازداری آنالیت منعکس می شود که در آن قدرت شستشوی زیاد باعث شستشوی سریع می شود. ترکیب فاز متحرک بر اساس شدت برهم کنش بین چندین جزء نمونه و فاز ثابت انتخاب می شود.
دستگاهوری کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)
1) مخازن حلال
یک دستگاه HPLC به یک و یا تعداد بیشتری مخازن شیشه ای مجهز است که گنجایش 500 میلی لیتر و یا بیشتر حلال را دارا هستند. مخازن اغلب به گاززدا (degasser) برای حذف گازهای حل شده مجهزند. وجود گازهایی مانند اکسیژن و نیتروژن در فاز متحرک که با تشکیل حباب همراه است، سبب پهن شدن پیک می شوند و علاوه براین، اغلب با عملکرد آشکارساز تداخل می کنند.
فاز متحرک باید خلوص بالا، واکنش پذیری پایین و سمیت و اشتعال پذیری کم داشته باشد. در انتخاب حلال برای آنالیز مواد، باید نقطه جوش حلال (باید 50-20 درجه بالاتر از ستون باشد) و قابلیت تطابق حلال با آشکارساز مد نظر قرار گیرند.
2) پمپ
چون ستون ها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است، به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که محلول جریان داشته باشد باید فشار وجود داشته باشد. پمپ، محلول را از مخزن می گیرد و با سرعت معین و کنترل شده آن را از ستون عبور می دهد. یک پمپ مناسب باید بتواند فشاری حدود 6000psi تولید کند، خروجی یکنواخت و بدون پالس و بدون فشار برگشتی (back pressure) داشته باشد، سرعت جریان های در گستره 10-0/1 میلی لیتر بر دقیقه (mL/min) را با تکرارپذیری مناسب تأمین کند و اجزای مقاومی در مقابل خوردگی داشته باشد.
انواع پمپ های متداول مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا:
- پیستونی رفت و برگشتی (Reciprocating Piston pumps)
- پمپ جابجایی یا سرنگی (Screw driven syringe pump)
- پمپ بادی (Pneumatic pumps)
متداول ترین پمپ مورد استفاده (بیش از 90%) در دستگاه های تجاری HPLC از نوع پیستونی هستند. پمپ های پیستونی از طریق حرکت رفت و برگشتی پیستون در یک محفظه هیدرولیک، حلال را انتقال می دهند. دو شیر یک طرفه که به تناوب باز و بسته می شوند، جریان حلال را به داخل و خارج سیلندر کنترل می کنند. پمپ های پیستونی فشار خوبی تولید می کنند، سرعت جریان ثابت ایجاد می کنند و برای شویش های ایزوکراتیک و گرادیانی مناسب هستند اما جریان تپی ایجاد می کنند که در صورت عدم حذف آن سبب ایجاد نوفه (نویز) در خط پایه کروماتوگرام می شود.
پمپ ها به دو روش عمل می کنند: ایزوکراتیک (Isocratic) و گرادیانی.
در روش ایزوکراتیک ترکیب ثابتی از حلال منتقل می شود. بنابراین، در استفاده از دو یا چند حلال، از قبل مخلوط با نسبت های مورد نظر آماده می شود (در واقع پمپ فقط از یک مخزن، حلال برداشت می کند). بنابراین، ترکیب فاز متحرک در طول آنالیز، ثابت است. این روش برای جداسازی های ساده بسیار مناسب است. این نوع پمپ ها به خاطر عملکرد ساده ای که دارند، ارزان تر هستند.
در نوع گرادیانی، ترکیب متغیری از حلال منتقل می شود. قابلیت برداشت از چند مخزن حلال وجود دارد. ترکیب فاز متحرک در طول آنالیز متغیر است. برای جداسازی های پیچیده بسیار مناسب هستند.
3) تزريق كننده نمونه
محفظه تزریق نمونه، برای وارد کردن نمونه به فاز متحرک است. ساده ترین وسیله برای وارد کردن نمونه، تزریق سرنگی از درون یک درپوش الاستیک است. متداول ترین روش وارد کردن نمونه در کروماتوگرافی مایع، بر اساس حلقه های نمونه بردار (sample loop) است. حلقه های نمونه بردار قابل تعویض بوده و ظرفیت آنها از 500-5 میکرولیتر است. برای دست یابی به کارایی بالای ستون، نمونه باید در اندازه مناسب و به صورت توده ای (plug)، وارد ستون شود. تزرق آرام و اندازه نامناسب نمونه باعث پخش شدن آن در ستون و جداسازی ضعیف می شود.
4) ستون
ستون های کروماتوگرافی مایع معمولاَ از لوله های فولاد ضد زنگ با منفذ یکنواخت ساخته می شوند و طول آنها حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. قطر داخلی ستون های مایع اغلب 4 تا 10 میلی متر است. متداول ترین اندازه پرکننده ها، 5 و 10 میکرومتر هستند. این ذرات اغلب با فیلم های نازکی از مواد آلی اندوده گردیده اند که به طور شیمیایی و یا فیزیکی به سطح پیوند شده اند.
در ستون های اولیه این روش، فاز ساکن یک مایع امتزاج ناپذیر با فاز متحرک بود که با جذب سطحی فیزیکی روی سطح پرکننده نگه داشته شده بود. امروزه، ستون های فاز پیوندی (Bonded-phase) با مزایای بیشتری که نسبت به ستون های اولیه دارند، کاملاً جایگزین ستون های قبلی شده اند. در این ستون ها فاز ساکن به صورت شیمیایی به سطح تکیه گاه متصل می شود. پرکننده های فازپیوندی اغلب از سیلیس یا ترکیبات با پایه سیلیس تهیه می شوند. این پرکننده ها ذرات یکنواخت، متخلخل و محکم با قطر 10-3 میکرومتر می باشند.
براساس قطبیت نسبی فازهای متحرک و ساکن کروماتوگرافی، HPLC به دو دسته تقسیم می شود:
کروماتوگرافی فاز نرمال (Normal phase):
فاز ساکن، قطبی و فاز متحرک، غیرقطبی است. فاز پیوندی بر پایه ترکیبات سیلیکا با عامل های آمین (-C3H6NH2) و سیانو (-C2H4CN) و فاز متحرک، حلال های غیر قطبی مانند هگزان و ایزوپروپیل اتر هستند.
کروماتوگرافی فاز معکوس (Reverse phase):
فاز ساکن، غیرقطبی و فاز متحرک، قطبی است. فاز پیوندی بر پایه ترکیبات سیلیکا دارای هیدروکربن (C8 , C18) و فاز متحرک، حلال های قطبی مانند آب، اتانول، استونیتریل، متانول و ..است.
در كروماتوگرافي فاز نرمال، جزء با كمترين قطبيت، کمتر بازداری می شود و زودتر از ستون خارج می شود، زيرا از همه بيشتر در فاز متحرك حل مي شود. با افزایش قطبیت فاز متحرک، زمان شويش كاهش مي يابد. برعكس، در روش فاز معكوس، قطبي ترين جزء، ابتدا ظاهر مي شود و افزايش قطبیت فاز متحرک، زمان شويش را افزايش مي دهد.
ستون محافظ (guard column):
وظیفه حفاظت از ستون اصلی را به عهده دارد و نمونه پس از تزریق ابتدا وارد این ستون می شود و سپس وارد ستون تجزیه ای (Analytical column) می گردد. به همین جهت، به این ستون ها پیش ستون (Pre-column) نیز می گویند. طول این ستون ها در حد چند سانتی متر بوده و با مواد پر کننده مشابه ستون تجزیه ای پر می شوند. به این دلیل که اگر ماده ای در نمونه حضور داشته باشد که با ذرات ستون وارد واکنش شود، در ستون محافظ به دام افتاده تا ستون تجزیه ای آسیبی نبیند.
5) آشکارساز
آشکارسازها گستره وسیعی از وسایل پیچیده و حساس هستند که به حضور اجزاء موجود در فاز متحرکی که از ستون خارج می شود، پاسخ الکتریکی مناسبی می دهند. اگر آشکارسازی بتواند به تمام انواع نمونه های موجود پاسخ قوی دهد، یک آشکارساز عمومی (universal) و اگر فقط به گروه یا ترکیبات ویژه ای واکنش نشان دهد، یک آشکارساز انتخابی ست.
یک آشکارساز ایده آل باید حساسیت مناسب داشته باشد، پایدار باشد و از دقت، صحت و تکرارپذیری مناسبی برخوردار باشد. حد تشخیص (detection limit) و گستره خطی (linearity range) آشکارساز برای آنالیزهای کمی بسیار اهمیت دارد.
آشکارسازها در کروماتوگرافی مایع به دو دسته کلی تقسیم می شوند.
- آشکارسازهای خاصیت – توده (bulk-property) که به خاصیت توده ای فاز متحرک مانند ضریب شکست، ثابت الکتریکی، چگالی و ویسکوزیته پاسخ می دهند.
- آشکارسازهای حل شده – خاصیت (solute-property) که به خاصیت جسم حل شده پاسخ می دهند مانند فلوئورسانس و جذب.
در جدول 1 انواع آشکارسازهای متداول HPLC همرا با توصیفی از زمینه کاربردی و محدودیت هرکدام ارائه شده است.
آشکارساز جذبی ماوراء بنفش- مرئی (UV-Vis absorption detector)
متداول ترین آشکارساز مورد استفاده در HPLC است. فاز متحرک خروجی از ستون وارد یک سل کوچک می شود. این سل در واقع محفظه نمونه یک طیف سنج جذبی است که با برخورد اشعه ماوراء بنفش و مرئی، حل شده های حاوی گروه های کروموفور قسمتی از آن را جذب می کنند. اختلاف شدت جذب نور وقتی که فقط فاز متحرک (بدون نمونه) عبور می کند و وقتی با نمونه عبور داده می شود، نشان دهنده میزان نمونه است.
این آشکار ساز حساسیت و پایداری خوبی دارد. اين آشکارسازها انتخابگر بوده و فقط مي توانند اجزاي نمونه اي كه نور مرئي/ماوراء بنفش را جذب می كنند، آشكار کنند. آشکارساز UV در محدوده طول موج 370-190 نانومتر و آشکارساز Vis در محدوده طول موج 700-400 نانومتر کار می کنند ولی بیشتر آشکارسازهای امروزی طوری طراحی شده اند که هر دو محدوده را پوشش می دهند. متداول ترین طول موج مورد استفاده، طول موج 254 نانومتر است.
آشکارسازهای آرایه دیودی نوری (PDA) (Photo Diode Array):
از تعداد زیادی دیود با آرایش مناسب تشکیل شده اند که امکان اندازه گیری همزمان بیش از یک نوع جزء جذبی را در طول موج های مختلف فراهم می کنند. آشکار ساز UV-Vis، نتایج دو بعدی می دهند یعنی شدت نور بر حسب زمان ولی درPDA، بعد سوم، طول موج نیز اضافه می شود. این کار منجر به کاهش زمان آنالیز و صرفه جویی در حلال می شود.
آشکارساز جذبی زیر قرمز-تبدیل فوریه (FTIR) (Fourier Transform Infrared):
براساس جذب امواج زیرقرمز آنالیت استوار است. محدودیت اصلی این آشکارساز این است که بیشتر حلال های کاربردی و مفید مانند آب و الکل ها برای امواج مادون قرمز عبور کمی دارند (جاذب پرتو تابشی IR هستند)، بنابراین کاربرد محدودی دارد.
آشکارساز ضریب شکست (RI) (Refractive Index)
اين آشكارساز تغییرات ضریب شکست را اندازه گیری می کند. یک سل شیشه ای به دو محفظه مشابه تقسیم می شود. خروجی ستون وارد محفظه نمونه شده و یک محفظه دیگر فقط از فاز متحرک پر می شود. اگر خروجی ستون حاوی آنالیت باشد، نور تابیده شده در نتیجه اختلاف در اجزاء در دو محفظه سل، شکست می یابد. اندازه این تغییرات نشان دهنده حضور اجزاء نمونه است. این آشکارساز حساسیت کمتری از آشکارسازهای جذبی دارد. به همه ترکیبات پاسخ می دهد. وقتی نمونه ها گروه های کروموفور ندارند، مانند قند، الکل یا یون های غیر آلی، و همچنین وقتی حلال جاذب نور UV-Vis است، بسیار مفید است. این آشکار ساز قابلیت استفاده در روش شویش گرادیانی را ندارد چون ترکیب فاز متحرک در حال تغییر است.
آشکارساز پراش نور تبخیری (ELS) (Evaporating Light Scattering)
این آشکارساز حساسیت خوبی برای ترکیبات غیرفرار و با جرم مولکولی بالا فراهم می کند. بعد از عبور خروجی ستون از یک محفظه داغ و تبخیر فاز متحرک، ذرات ریز تشکیل شده تحت تابش یک پرتو لیزری قرار می گیرند و پرتو پراش شده برای شناسایی ترکیبات موجود استفاده می شود. این آشکارساز برای شناسایی ترکیبات قندی، چربی ها و ترکیبات با وزن مولکولی بالا بکار می رود. حساسیت بیشتری از آشکارساز RI دارد و با شویش گرادیانی نیز قابل استفاده است.
آشکارساز هدایت سنجی (Conductivity detector)
محلول های حاوی گونه های یونی، رسانایی الکتریکی دارند. آشکارساز هدایت سنجی، مقاومت الکتریکی را اندازه گیری می کند که مستقیما متناسب با غلظت یون های موجود در نمونه است. این آشکار ساز بیشتر برای کروماتوگرافی تعویض یونی بکار می رود. ثابت سل الکتروشیمیایی و دما باید پایدار باشد.
آشکارساز فلوئورسانس (FL) (Fluorescence)
مزیت عمده این آشکارساز حساسیت و گزینش پذیری بالاست اما ترکیب موردنظر باید خاصیت جذب فلوئورسانس داشته باشد. با استفاده از یک طول موج خاص، اتم های آنالیت برانگیخته شده و نشر فلوئورسانس آنها متناسب با غلظت اتم خواهد بود. برای ترکیباتی که خاصیت فلوئورسانس ندارند، می توان با مشتق سازی با ترکیبات فلوئورسانس مانند دنزیل کلراید (dansylchloride) و تبدیل به یک ترکیب فلوئورسانس آنالیز شوند.
آشکارساز الکتروشیمیایی (EC) (Electrochemical)
انواع مختلف آشکارسازهای الکتروشیمیایی وجود دارد. روش های شناسایی می توانند بر اساس آمپرومتری، ولتامتری، کولومتری و پلاروگرافی باشند. این آشکارسازها گزینش پذیری و حساسیت بالایی دارند، ساده و راحت هستند و دامنه کاربرد وسیعی دارند. بسیار به نویز حساس هستند و هرگونه آسیب یا رسوب گذاری روی الکترود، حساسیت را تحت تأثیر قرار می دهد.
آشکارساز طیف سنج جرمی (Mass Spectrometry detectors)
یکی از قوی ترین آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع (LC) است که تلفیقی از روش LC و طیف سنج جرمی است و به اختصار LC-MS نامیده می شود. در طیف سنج جرمی جداسازی یون ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) آنها و تحت تأثیر میدان های الکتریکی و مغناطیسی صورت می گیرد. در واقع اجزای نمونه پس از جداسازی در ستون کروماتوگرافی، وارد محفظه یونش طیف سنج جرمی می شوند و با استفاده از میدان های الکتریکی و مغناطیسی، شناسایی کمی و کیفی اجزاء نمونه براساس m/z صورت می گیرد.
آنالیز کمی و کیفی
جهت شناسايی کیفی مواد با HPLC از زمان بازداری (tR) استفاده مي شود. زمان بازداری زماني است كه طول مي كشد تا جسم از آشکارساز خارج شود، يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پیک ها روی دستگاه كه براي هر جزئی در نمونه تحت شرايط ثابت، مقداري ثابت است. از مقايسه زمان بازداری نمونه یا جزء معلوم با زمان بازداری نمونه مجهول، مي توان اجزاي موجود در نمونه مجهول را تشخيص داد.
آنالیز کمی با استفاده از روش های کالیبراسیون صورت می گیرد. روش استاندارد خارجی (external standard) متداول ترین روش جهت محاسبه مقدار مجهول است که در آن منحنی کالیبراسیون ارتفاع یا سطح زیر پیک از کروماتوگرام محلول های استاندارد (محلول هایی با غلظت های مختلف از استاندارد آنالیت مورد نظر) بر حسب غلظت آنالیت ها در محلول های استاندارد رسم می شود. با استفاده از معادله خط بدست آمده و با اندازه گیری ارتفاع یا سطح زیر پیک نمونه مجهول، مقدار دقیق آنالیت محاسبه می شود.
روش های افزایش استاندارد (standard addition) و استاندارد داخلی (Internal standard) از دیگر روش های کالیبراسیون هستند که برای حذف اثرات ماتریس و خطای موجود در سیستم به کار می روند.
مزایای آنالیز HPLC
- آنالیز ترکیبات غیرفرار و ناپایدار حرارتی
- تنوع زیاد آشکارسازهای انتخابی که سبب حساسیت زیاد روش می شود.
- کاربرد گسترده تحقیقاتی و صنعتی
- شناسایی و آنالیز ترکیبات با ساختار مشابه
- کاربرد برای اسیدهای آمینه، جداسازی، خالص سازی و شناسایی پروتئین‌ها (همچنین تحقیقات پروتئومیک)، اسیدهای نوکلئیک، هیدروکربنها، هیدراتهای کربن، داروها، ترپنوئیدها، حشره‌کش‌ها، آنتی‌بیوتیکها، استروئیدها، گونه‌های آلی و گروهی از مواد گوناگون معدنی و همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت داروها.
- مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف
- تعیین ساختار پلیمرها
- راندمان جداسازی بیشتر نسبت به سایر روشهای کروماتوگرافی
- روشی غیرمخرب
محدودیت های آنالیز HPLC
- استخراج چندمرحله ای
- بازده جدایی کمتر نسبت به کروماتوگرافی گازی مویرگی
کاربردهای آنالیز HPLC
صنعت دارو:
کنترل کیفی برای تطابق محصولات با استانداردها، برای تحقیق و توسعه جهت شناسایی و آنالیز داروهای جدید
صنایع غذایی:
آنالیز باقیمانده سموم و حشره کش ها، آنالیز پروتئین ها، اسیدهای آمینه، قندها، کلسترول، انواع ویتامین ها و …، تشخیص تقلب در مواد غذایی
محیط زیست:
آنالیز انواع آلاینده های محیطی در آب و پساب ها
صنعت:
بیوتکنولوژی، پتروشیمی و کاتالیز
انواع پیشرفته تر HPLC عبارتند از:
کروماتوگرافی مایع با عملکرد فوق العاده بالا (uHPLC)
در روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا معمولا اندازه ذرات 5-3 میکرومتر و فشار حدود 400 بار است. در روش (UPLC) (Ultra Performance Liquid Chromatography) از ستون های ویژه ای با اندازه ذرات 1/7 میکرومتر و فشار بیش از 1000 بار استفاده می شود. مزیت عمده روش UPLC، سرعت آن است. دستگاه های UPLC سریع تر، حساس تر، مصرف حجم های کمتر حلال آلی و در نتیجه توانایی آنالیز نمونه بیشتر در زمان کمتر نسبت به دستگاه های HPLC را دارا هستند. از مشکلات این روش کاهش عمر ستون به دلیل استفاده از فشارهای بالاست.
کروماتوگرافی مایع پروتئین سریع (FPLC)
FPLC سیستمی مشابه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا است که برای جداسازی یا تصفیه پروتئین ها و سایر مولکول های زیستی از مخلوط های پیچیده استفاده می شود. تفاوت اصلی بین FPLC و HPLC فشار کاری استاندارد است. ستون های FPLC فقط تا حداکثر فشارهای 5-3 مگاپاسکال قابل استفاده هستند. اگر فشار HPLC محدود شود، تقریباً هر ستون FPLC نیز می تواند در سیستم HPLC استفاده شود.